RT - PCR法不僅可以用來(lái)檢測(cè)特定基因也semi-quantitate水平。因此，一個(gè)可以比較轉(zhuǎn)錄水平在不同的樣品。這可以通過(guò)不同的方式。一是定量反轉(zhuǎn)錄水平從控制，看家基因（如肌動(dòng)蛋白和）。（轉(zhuǎn)錄的看家基因被認(rèn)為是受了幾乎所有的實(shí)驗(yàn)條件。）另一種方法是添加一個(gè)引物特異性聚合酶鏈反應(yīng)在反應(yīng)外源性，模板。

量化對(duì)看家基因轉(zhuǎn)錄

該方法包括逆轉(zhuǎn)錄使用寡核苷酸引物和隨機(jī)引物。由此產(chǎn)生的基因從而代表兩個(gè)看家基因轉(zhuǎn)錄以及具體的成績(jī)單是量化。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)然后放大在一個(gè)對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)系列-一系列放大看家基因（用磷酸甘油醛脫氫酶，等等，特異性引物），和其他的特定基因的興趣（在不同的基因，利用基因特異性引物）。

不同的聚合酶鏈反應(yīng)管內(nèi)的每一個(gè)系列的建立等，他們在不同的數(shù)額模板（金額逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物[基因]）或進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)不同。這是因?yàn)椋?/span>聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，雖然理論上對(duì)數(shù)，不太高或低數(shù)量擴(kuò)增周期。對(duì)數(shù)和指數(shù)擴(kuò)增通常只發(fā)生在中東的周期，這取決于濃度目標(biāo)模板。比較因此可以只在這一階段。

聚合酶鏈反應(yīng)后，同體積的反應(yīng)產(chǎn)物的電泳瓊脂糖凝膠上（是在同一凝膠）。圖像的彩色脫氧核糖核酸（產(chǎn)物）然后獲得和分析的視覺(jué)比較或與計(jì)算機(jī)軟件（如圖像論文）。一個(gè)例子是如下，半定量的目視檢查是表達(dá)fut9基因在細(xì)胞系，lec12和lec29。

可以看出，1）兩個(gè)細(xì)胞系，指數(shù)擴(kuò)增兩型和fut9發(fā)生在周期33 - 42。2）本型帶強(qiáng)度在這些周期表明幾乎相同水平的模板（基因）是用于什么細(xì)胞系。3）的fut9水平約6 - 9周期＇behind ＇ ＇ lec12比lec29。

注釋

1。應(yīng)該做一個(gè)試點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，首先是要確保只有單一的，具體的產(chǎn)品獲得的引物，得到一個(gè)想法的一系列周期或逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)稀釋使用。

2。一開(kāi)始應(yīng)該與等量的核糖核酸聚合酶反應(yīng)。

3。所有的反應(yīng)進(jìn)行的同時(shí)，使用試劑，準(zhǔn)備作為一個(gè)supermix減少任何變化。

4。產(chǎn)物應(yīng)該是運(yùn)行在同一凝膠，再減少任何變化。

5。當(dāng)定量比較罕見(jiàn)的成績(jī)單，它可以更好地用于控制那些看家基因的轉(zhuǎn)錄本在一個(gè)較低的水平。例如，謄醛縮酶表示在一個(gè)較低的水平相比，基因。

6。當(dāng)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)不同周期數(shù)，建立聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)，消除他們一點(diǎn)零一分在中東的擴(kuò)展階段期間所需的聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)數(shù)。然后放在水浴在65～75℃幾分鐘保證延伸完成。

7。當(dāng)反應(yīng)不同反應(yīng)量（通常是一個(gè)系列的2或3倍稀釋），稀逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，沒(méi)有模板的不同反應(yīng)的反應(yīng)有相同數(shù)量的反應(yīng)（但不同數(shù)量的基因）。這是必要的，因?yàn)?/span>成分比其他基因的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（如逆轉(zhuǎn)錄，數(shù)碼地面電視，等）可以影響反應(yīng)效率。

半定量使用外源性標(biāo)準(zhǔn)

一個(gè)可以有外源性標(biāo)準(zhǔn)（無(wú)論是核糖核酸或核酸），可以被放大使用相同的引物，擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄的興趣。本標(biāo)準(zhǔn)的目的是有相同的序列的轉(zhuǎn)錄興趣除了是40 - 50個(gè)核苷酸短或更長(zhǎng)。不同數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)是用來(lái)在不同的聚合酶鏈反應(yīng)的反應(yīng)（如標(biāo)準(zhǔn)是一種核糖核酸，它是前加入逆轉(zhuǎn)錄步驟）和擴(kuò)增相同數(shù)量的周期。外源性標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)與內(nèi)源性模板，因此，這個(gè)策略也被稱(chēng)為競(jìng)爭(zhēng)性RTP CR。

產(chǎn)品electophoresed和定量的軟件和一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的＇amount ＇ ＇與＇強(qiáng)度＇ ＇ ＇band繪制。

在這個(gè)例子中所示，產(chǎn)品1是從標(biāo)準(zhǔn)和2是由內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄。可以看出，數(shù)額標(biāo)準(zhǔn)加入的反應(yīng)為5道大致等于轉(zhuǎn)錄量。

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